①豌豆杂交实验中,需在自花授粉前对母本人工去雄,①正确;
②对母本的去雄应该在开花前,②错误;
③去雄后要套袋隔离,再进行人工授粉,③错误;
④去雄后进行人工授粉,④正确;
⑤授粉后需要套袋隔离,防止外来花粉干扰实验结果,⑤正确;
⑥授粉后要套袋隔离,⑥错误;
故选:D.
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