A、稀释涂布平板法首先要将菌液进行一系列的梯度稀释,A正确;
B、稀释后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面,B正确;
C、平板涂布后要将培养皿放在适宜的条件下培养让菌体进行繁殖,C正确;
D、在不同稀释度的菌液接种后,只有在一定的稀释度的菌液里,聚集在一起的微生物才能分散成单个细胞,从而能够在培养基表面形成单个菌落;如果稀释度过低,将不会形成单个菌落;如果稀释度过高,可能没有菌落生成,D错误.
故选:D.
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