A、基因表达载体构建过程中需要限制酶和DNA连接酶两种工具酶的协助,A正确;
B、基因工程的操作中基因表达载体构建是在体外条件下进行的,B错误;
C、抗生素抗性基因或荧光标记基因可作为标记基因,便于目的基因的筛选,C正确;
D、基因表达载体包括启动子、终止子、目的基因、标记基因,其中启动子位于目的基因的首端,终止子位于目的基因的末端,D正确.
故选:B.
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