革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤。其原理为：细菌细胞经过初染和媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，G+菌由于其细胞壁较厚，肽聚糖网层次较多且交联致密故遇乙醇脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理时，细胞壁上不会溶出缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其呈现出蓝紫色；而G-菌细胞壁薄，肽聚糖层薄且交联松散，外壁层类脂含量高，在遇乙醇后，细胞壁上会溶出较大的空洞或缝隙，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经红色染料(如暮红)复染，就使G-菌呈红色。由此可见，革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。
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